PCR jest jedną z najczęściej stosowanych technik w laboratoriach nauk przyrodniczych. Niestety, przy przetwarzaniu dużych partii próbek łatwo o błędy, takie jak przetworzenie niewłaściwej próbki lub zapomnienie o dodaniu odczynnika. Oto 13 sposobów unikania błędów podczas prowadzenia reakcji PCR lub jej pochodnych, w tym qPCR.
1 - Zapewnij sterylne środowisko
Zanieczyszczenia mogą prowadzić do fałszywych wyników ujemnych lub dodatnich, co może spowodować, że użytkownik będzie musiał ponownie zweryfikować swoje wyniki. Zanieczyszczenia te mogą występować w wielu postaciach, od obcego DNA po inhibitory chemiczne, które zmniejszają wydajność reakcji. Aby zminimalizować zanieczyszczenie próbek PCR i odczynników, można zrobić kilka rzeczy:
- Używać sterylnych końcówek filtrujących, które zapobiegną przedostawaniu się zanieczyszczeń z pipety do próbek.
- Przeznaczyć czysty zestaw sprzętu, w tym statywy i pipety, wyłącznie do prowadzenia reakcji PCR. Zapewni to minimalne przenoszenie cząstek z jednej części laboratorium do drugiej.
- Wydzielić miejsce na wszystkie reakcje PCR, aby jeszcze bardziej ograniczyć zanieczyszczenie cząsteczkami.
- Stosować etanol, wybielacz i RNaseOUT na stanowisku, pipetach i stojakach, aby wypłukać zanieczyszczenia.
- Na każdym etapie należy używać rękawiczek i często je zmieniać.
2 - Sprawdź czystość i stężenie szablonu
Niezależnie od tego, jak czyste jest stanowisko i sprzęt, nadal konieczne jest sprawdzenie czystości próbek przed ich pobraniem. Większość analizatorów mierzy obecnie jednocześnie stężenie i czystość DNA. Zawsze upewnij się, że stosunek absorbancji 260 nm/280 nm wynosi co najmniej 1,8. Inne długości fal pomiędzy 230 nm a 320 nm mogą być wykorzystywane do wykrywania zanieczyszczeń. Na przykład, wysoka absorbancja przy 230 nm sugeruje obecność związków organicznych lub soli chaotropowych, natomiast wysoki odczyt przy 320 nm wskazuje na zmętnienie próbki DNA, co może być wynikiem zanieczyszczenia.
3 - Sporządzić inwentaryzację pobranych odczynników do PCR
Cykle zamrażania/rozmrażania mogą spowodować spustoszenie w odczynnikach, jeśli powtórnie użyjemy jednej porcji zbyt wiele razy, uszkadzając enzymy i dNTP w wyniku rekrystalizacji. Przygotowując próbki, należy śledzić, ile razy każda porcja została użyta, najlepiej za pomocą systemu LIMS, który może zarządzać całym inwentarzem, w tym liczbą prób i odczynników, które były zamrażane/rozmrażane.
4 - Upewnij się, że wybrałeś właściwą temperaturę annealingu
Innym sposobem na pojawienie się błędów w wynikach PCR jest zastosowanie niewłaściwej temperatury annealingu dla danego zestawu primerów. Jeśli reakcja nie przebiega zgodnie z założeniami, kuszące jest obniżenie temperatury annealingu, aby zwiększyć szanse na udaną reakcję. Jednak im niższa temperatura, tym większe prawdopodobieństwo pojawienia się dimerów primerów i wyników fałszywie dodatnich. Ważne jest sprawdzenie analizy krzywej topnienia podczas wykonywania qPCR, ponieważ jest to dobry wskaźnik tego, czy wybrano właściwą temperaturę wyżarzania. W przypadku nowych starterów należy zawsze pamiętać o określeniu optymalnej temperatury annealingu przed wykonaniem próbek. Następnie można sporządzić tabelę - najlepiej w systemie LIMS - zawierającą zestawy primerów i odpowiadające im ustawienia protokołu PCR. Oprogramowanie do projektowania primerów może również pomóc we wstępnym projektowaniu, zapewniając odpowiednie dopasowanie temperatur annealingu.
5 - Unikaj przeładowania studzienek produktem
Kuszące jest pobieranie jak największej ilości produktu, zwłaszcza gdy nie ma pewności, jak wydajna jest reakcja PCR. Jednak wprowadzenie wystarczająco dużej objętości produktu do żelu agarozowego może spowodować zanieczyszczenie krzyżowe dołków. Skośne wyniki nie tylko marnują próbkę, ale także utrudniają identyfikację próbek, zwłaszcza jeśli przeładowano próbki obok studzienek kontrolnych.
6 - Sprawdzać każdy odczynnik po dodaniu go do mieszaniny wzorcowej
Do każdej reakcji PCR lub qPCR co najmniej 3 odczynniki, jeśli nie więcej, muszą być dodane do mieszaniny wzorcowej, która następnie może być alikwotowana do dowolnej liczby studzienek. Sprawdzanie odczynników w miarę ich dodawania jest konieczne, aby mieć pewność, że każdy odczynnik został dodany w odpowiednim stężeniu i nie został pominięty lub dodany ponownie w nieodpowiedni sposób. Najlepszym sposobem jest skanowanie etykiet z kodami kreskowymi każdego odczynnika natychmiast po jego dodaniu do mieszaniny. Stosowanie mieszaniny wzorcowej pomaga również zminimalizować potrzebę pipetowania naprawdę małych objętości, co może spowodować przekroczenie granic dokładności pipety.
7 - Używaj odpowiednich etykiet
Etykietowanie ma kluczowe znaczenie dla uniknięcia błędów w PCR. Jednak miejsce przeznaczone na probówki do PCR i płytki do ilościowej PCR (qPCR) jest zwykle stosunkowo niewielkie, co sprawia, że pisanie odręczne jest nieefektywnym sposobem identyfikacji próbek. Obecnie na rynku dostępnych jest kilka rozwiązań w zakresie etykietowania probówek, pasków i płytek do PCR, ale najlepszym z nich jest PCR-TagTrax™, przyjazna dla rękawic, bezklejowa etykieta, która mieści się wokół stożkowej części probówki. Znaczniki umożliwiają drukowanie większej ilości informacji niż inne metody etykietowania, mogą być kodowane kolorami i są kompatybilne z większością termocyklerów.
8 - Śledzenie próbek za pomocą LIMS
Integracja laboratoryjnego systemu zarządzania informacją (LIMS) z etykietami z kodami kreskowymi to kolejny świetny sposób na poprawę możliwości śledzenia próbek PCR. Po wygenerowaniu i przetworzeniu każdej próbki DNA etykiety z kodami kreskowymi są skanowane do systemu, a system LIMS rejestruje każde zadanie w miarę jego wykonywania. System może również organizować przechowywanie i wykorzystanie próbek i odczynników, informując na bieżąco o ich rozmieszczeniu w laboratoryjnych zamrażarkach i lodówkach oraz o objętościach pozostałych w każdej probówce.
9 - Ogranicz liczbę próbek
Ta wskazówka dotyczy niemal każdego badania przeprowadzanego w laboratorium. Praca z mniejszą liczbą próbek oznacza, że łatwiej jest je śledzić i uniknąć zamieszania, które powstaje przy przetwarzaniu próbki po próbce przez długi okres czasu. Metoda PCR jest szczególnie podatna na błędy przy stosowaniu wielu próbek, ponieważ probówki są tak małe, że odróżnienie probówki25. od26. może być często trudne. Chociaż etykiety z kodami kreskowymi mogą pomóc w uniknięciu tych błędów, zawsze warto unikać pobierania większej liczby próbek niż jest to konieczne i w miarę możliwości rozłożyć w czasie każdą analizę tak, aby czuć się komfortowo z obciążeniem pracą. Ponadto, chociaż stosowanie wielu zestawów primerów razem może zaoszczędzić czas, może to prowadzić do niepotrzebnych błędów, jeśli ich temperatury annealingu są różne. Nawet jeśli temperatury są zbliżone, nadal nie jest to zalecane.
10 - Dopasowywanie końcówek pipet do probówek z próbkami podczas dodawania próbek
Może się to wydawać stosunkowo oczywistą sztuczką, ale gdy mamy do czynienia z rzędami próbek, zwłaszcza w przypadku ładowania płytek 96-dołkowych za pomocą pipety jednokanałowej, niezwykle ważne jest posiadanie systemu dającego pewność, że dodaliśmy właściwe próbki do odpowiedniej probówki. Łatwo jest stracić koncentrację po pipetowaniu więcej niż 5 do 10 razy z rzędu, dlatego patrząc wstecz i dopasowując rzędy końcówek w pudełku do rzędów próbek, które należy pipetować, można się orientować w miarę dodawania każdej próbki. W razie wątpliwości, czy nie popełniono błędu, można spojrzeć wstecz na dokładne rozmieszczenie końcówek, aby wiedzieć, czy wystąpił błąd.
11 - Wybierz właściwą polimerazę
Nie istnieje jedna uniwersalna polimeraza DNA do PCR, dlatego ważne jest, aby przed rozpoczęciem eksperymentu wybrać właściwą polimerazę. Do rutynowych badań PCR można stosować standardową polimerazę termostabilną, ponieważ zazwyczaj charakteryzuje się ona szybkim tempem wydłużania; nie potrafi ona jednak przeprowadzać korekty, dlatego należy jej unikać w badaniach nad klonowaniem i mutagenezą.
Jeśli zaczynamy z małą ilością szablonu, przydatna może być polimeraza Hot-Start (HS), ponieważ zmniejsza niespecyficzną amplifikację, zwiększając wydajność pożądanych fragmentów. Ten typ polimerazy jest niekompatybilny z klonowaniem i mutagenezą, ponieważ nie posiada zdolności korekty.
Jeśli potrzebujesz polimerazy do badań nad klonowaniem lub mutagenezą, rozważ polimerazę o wysokiej wierności (Hi-Fi), która może przeprowadzać korektę dzięki aktywności egzonukleazy 3'-do-5' i zdolności do usuwania błędnych zasad z nici DNA.
12 - Wybierz wygodne miejsce do pracy
Stres i zmęczenie odgrywają dużą rolę w przyczynianiu się do powstawania błędów laboratoryjnych. Ważne jest, aby wybrać wygodne stanowisko pracy, które zapewni maksymalne wsparcie dla nadgarstków, szyi, pleców i nóg. Im dłużej można pracować bez obciążania stawów, tym mniejsze jest prawdopodobieństwo poślizgnięcia się i popełnienia błędu przy pipetowaniu.
13 - Kod kolorystyczny
Nie, nie mówimy tu o różnokolorowych sondach, których można używać do rozróżniania produktów PCR, choć są to również pomocne narzędzia. Kodowanie kolorami pojemników to prosty sposób na uniknięcie pomyłek podczas przeprowadzania PCR. Używanie kolorowych probówek, etykiet, a nawet mieszanin PCR zawierających barwniki to świetny sposób na identyfikację odczynników przed rozpoczęciem reakcji. Niektóre barwniki mogą nie być kompatybilne z PCR, dlatego warto je wcześniej przetestować, aby upewnić się, że nie spowodują utraty próbek DNA.
LabTAG firmy GA International jest wiodącym producentem wysokowydajnych etykiet specjalistycznychoraz dostawcą rozwiązań identyfikacyjnych stosowanych w laboratoriach badawczych i medycznych, a także w placówkach służby zdrowia.
